БЛОТИНГ

Після проведення електрофорезу для виявлення специфічних білків, їх взаємодій або певних нуклеїнових кислот виконують перенесення досліджуваного матеріалу на мембрану. Цей процес і є блотингом. Після цього, зазвичай, створюють комплекс з міченою молекулою для виявлення молекули інтересу.

За молекулами інтересу, які досліджують, класифікують декілька різновидів блотингу:

• ● Вестерн-блотинг (білки)
• ● Саузерн-блотинг (ДНК)
• ● Нозерн-блотинг (РНК)
• ● Істерн-блотинг (посттрансляційні модифікації білків)
• ● Фар-вестерн-блотинг (взаємодія білків)

Загальна техніка блотингу

Техніка блотингу виконується за загальною процедурою:

• ● Виділення зразка із матеріалу.
• ● Розділення молекул шляхом проведення електрофорезу.
• ● Перенесення молекул на мембрану.
• ● Інкубація мембрани з міченими зондами.
• ● Виявлення молекул інтересу.

Характеристики та порівняння саузерн-, норзерн- та вестерн-блотингів

Техніка	Саузерн-блотинг	Норзерн-блотинг	Вестерн-блотинг
Мішень	ДНК	РНК	Протеїни
Попереднє розділення молекул	Електрофорез	Електрофорез	Електрофорез
Метод блотингу	Капілярне перенесення	Капілярне перенесення	Електрофоретичне перенесення
Матеріал мембрани	Нейлон	Нейлон	Нітроцелюлоза або полівінілідендіфторид
Зонди	Олігонуклеотиди	Олігонуклеотиди (а також РНК, ДНК)	Антитіла
Мічення зонду	Радіоміткою, ферментативно	Радіоміткою, ферментативно	Ферментативно
Методи виявлення	- Рентгенівські промені - Колориметрія - Хемілюмінісценція	- Рентгенівські промені - Колориметрія - Хемілюмінісценція	- Колориметрія - Хемілюмінісценція

САУЗЕРН-БЛОТИНГ

Саузерн-блотинг використовується для визначення специфічних послідовностей ДНК.

Фрагменти ДНК за допомогою капілярного перенесення потрапляють з гелю на нейлонову мембрану. Після цього мембрани інкубують з олігонуклеотидними зондами, які мають гомологічну послідовність до цільової послідовності. Ці зонди мічені радіоактивністю, флуоресцентним барвником або ферментом, здатним генерувати хемілюмінесцентний сигнал, що дозволяє ефективно виявляти смуги ДНК. Радіоактивно мічені зонди візуалізуються за допомогою рентгенівського випромінювання, а ферментативно мічені зонди візуалізуються за допомогою хемілюмінесцентного субстрату.

Саузерн-блотинг застосовують при вивченні мутацій (делецій, дуплікацій, перебудов хромосом), змін в метилюванні генів. Окрім того основними галузями застосування є криміналістична експертиза; визначення нових мутацій, що викликають хвороби; ідентифікація специфічних для злоякісних пухлин генетичних маркерів (наприклад, BCR-ABL1-злитий ген при ХМЛ).

НОЗЕРН-БЛОТИНГ

Нозерн-блотинг – це метод, що дозволяє виявляти РНК.

Увесь протокол виконання норзерн-блотингу є практично ідентичним до саузерн-блотингу. Окрім олігонуклеотидів зондами можуть виступати мічені РНК та ДНК. Методи візуалізації використовуються такі ж, як при саузерн-блотингу.

Застосовують норзерн-блотинг для визначення кількостей РНК та рівня експресії генів.

ВЕСТЕРН-БЛОТИНГ

Вестерн-блотинг використовується для ідентифікації та дослідження білків.

Протеїни електрофоретично переносяться з гелю на мембрану. У випадку вестерн-блотингу можна використовувати нітроцелюлозну або полівініліденфторидну мембрани. Мембрану інкубують з блокуючим агентом для запобігання неспецифічному зв’язуванню. Після цього мічення виконується з використанням антитіл. Є два варіанти використання антитіл:

• ● Використовуються мічені антитіла.
• ● Спочатку використовується не мічені первинні антитіла, з якими на другому етапі зв’язуються вторинні мічені антитіла.

Основними сферами застосування є діагностика інфекційних захворювань, дослідження різних аномалій протеїнів в організмі (наприклад, пріонна хвороба) та діагностика аутоімунних станів.

Незважаючи на те, що блотинг є повільним до виконання високовартісним методом, що вимагає великої кількості ДНК та РНК для аналізу, перевагами блотингу є висока специфічність методу, висока чутливість та велике різноманіття досліджуваного матеріалу, який можна використати, а також чисельні варіанти застосувань.

Системи для блотингу від Bio-Rad Laboratories: