Секвенування нового покоління (NGS)

Технологія визначає первинну структуру нуклеотидних послідовностей РНК та ДНК, що дозволяє проаналізувати сотні мішеней одночасно.

Секвенування застосовують для виявлення спадкових та соматичних мутацій, молекулярного профілювання пухлин, у медичній генетиці та для профілактики багатофакторних захворювань.

Золотим стандартом секвенування є метод Сенгера. Однак для багатьох застосувань його використання невиправдане через значну тривалість та високу вартість. З метою збільшення доступності секвенування для практичного застосування було розроблено нові підходи до аналізу первинної послідовності нуклеїнових кислот. Їх об’єднали під назвою Next Generation Sequencing – NGS.

На сьогодні найпоширенішими є секвенатори другого (MiSeq, NovaSeq, NextSeq та інші від Illumina, IonTorrent від Thermo Fisher Scientific) та третього (Revio, Onso, Sequel від PaciBio та MinION, GridION, PromethION від Oxford Nanopore) поколінь.

Як працює секвенування?

Нуклеїнову кислоту фрагментують. До отриманих фрагментів “пришивають” адаптери та унікальні ідентифікаторні послідовності. Адаптери забезпечують фіксацію фрагменту на платформі для забезпечення секвенування, а ідентифікаторні послідовності дозволяють відрізнити один зразок від іншого у випадку одночасного секвенування кількох зразків.

Після цього відбувається власне секвенування – визначення первинної нуклеотидної послідовності цих фрагментів. Секвенатори другого покоління “зчитують” послідовності довжиною кілька сотень нуклеотидів. Платформи третього покоління – десятками тисяч нуклеотидів. Так, наприклад, типові “прочитування” (reads) на платформі Illumina обмежуться 200-300 нуклеотидами, на платформах IonTorrent довжина може сягати 400 нуклеотидів. Секвенатори PacBio мають прочитування до 15 000 еуклеотидів. На платформах Oxford Nanopore вже вдалось досягти довжини в 200 000 нуклеотидів.

Отримані “прочитування” за допомогою спеціалізованих програм та алгоритмів складають, як пазли, у довші послідовності – контіги (contigs), аналізуючи ділянки, що перекриваються. Таким чином, чим довше “прочитування”, тим легше скласти первинну послідовність і тим більше можливостей отримати достовірну інформацію щодо крупних структурних перебудов.

Отриману послідовність порівнюють з референсним геномом.

Будь-яка технологія NGS допускає помилкові зчитування, тому дуже важливо відрізняти нуклеотидні заміни, викликані помилковими зчитуваннями, та мутації. Достовірність виявлених мутацій забезпечується достатньою глибиною прочитувань (depth). Чим більше глибина, тим вища ймовірність справжньості виявленої мутації.

Для чого використовують NGS?

Перелік застосувань методу обмежується тільки фантазією користувачів, адже сучасні технології дозволяють проводити надзвичайно різноманітні дослідження:

– Секвенування геномів (ДНК) – De novo та ресеквенування
– Секвенування транскриптомів (РНК) – De novo та для аннотованих геномів
– Кількісні методи – визначення конформації геномів чи позиції протеїнів на ДНК

Медична генетика

У медичній діагностиці NGS використовують для ресеквенування геномів та транскриптомів з метою виявлення змін, які впливають на функціонування організму.

Секвенування всього геному для діагностики не є необхідним, тому в залежності від задачі, ресеквенують тільки частину геному:

– Таргетна панель (до 500 генів)
– Клінічний екзом (близько 5 000 важливих генів)
– Повний екзом (більше 20 000 генів)

Онкологічні дослідження

В основі онкологічних захворювань часто лежить різноманітна генетична основа і багато геномних аберацій – від однонуклеотидних варіантів (single nucleotide variants – SNV) до структурних варіантів (structural variants – SV), химерних (злитих) транскриптів, епігенетичних мутацій (наприклад, метилювання ДНК та РНК), які можуть спричиняти, сприяти або вказувати на захворювання. Дослідники традиційно покладаються на різноманітні методи для ідентифікації та аналізу різних форм раку.

Мікробіологія

NGS дозволяє визначити якісний та кількісний склад мікробіомів кишечника, сечостатевої системи, респіраторного тракту, а також виявити специфічні мікроорганізми, які важко детектувати традиційними методами. Секвенування за допомогою платформ Oxford Nanopore дає можливість виявляти стійкість до антибіотиків (резистентність) в реальному часі.

Рослинництво

У рослин ознаки (соковитість, плідність, солодкість, поживність тощо) часто пов’язані з великою плоїдністю та множинними повтореннями у геномі, також часто зустрічаються структурні перебудови геномів, транспозони та трансгенні інсерції, метилювання. Виявлення їх дозволяє відкрити нові горизонти у рослиннцитві, еволюції та селекційних стратегіях.

Тваринництво

Застосування NGS у твариннцитві дуже різноманітне: від використання тварин в якості моделей для вивчення хвороб людей до виявлення проблем зі здоров’ям тварин, виведення певних порід, збереження певних видів та вивчення еволюції організмів.